孙铭泽, 尹 玲
(济宁学院化学化工与材料学院,山东 曲阜 273155)
基质金属蛋白酶(MMPs)几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,在肿瘤侵袭转移中起着关键作用,因此被大量应用于肿瘤细胞早期检测和治疗研究中[1-3]。Fe3O4纳米颗粒因其尺寸小、比表面积大、超顺磁性和毒性小等特点,已应用到医学、生物学和材料科学等多个研究领域[4-9]。聚乙二醇(PEG)可以增加极性官能团的密度,使修饰后的磁性纳米颗粒具有很好的水溶性和稳定性,成为金属纳米粒子常用的表面修饰剂[10-11]。当金属纳米颗粒与荧光分子连接时,会使荧光分子出现明显的荧光淬灭现象。近年来大量文献报道,“点亮型”荧光纳米探针被广泛应用于化学传感、生物检测和医学成像等研究领域[12-13]。首先合成Fe3O4纳米颗粒,并在其表面修饰PEG,再与异硫氰酸荧光素(FITC)修饰的MMP-2特异性识别的多肽底物KCPLGVR偶联,成功制备得到一种新型MMP-2特异性响应纳米分子探针Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC,研究了其体外对MMP-2蛋白酶的检测灵敏度和特异性,并进行了过表达MMP-2的MCF-7细胞成像研究。实验结果表明,该探针在MMP-2过表达的肿瘤早期诊断方面具有一定的应用潜力。
1.1 KCPLGVR-FITC的合成、纯化和表征
如图1,将三乙胺(TEA,9.8 mg,0.096 mmol)和叠氮丙胺(9.6 mg,0.096 mmol)分别滴加到溶有异硫氰酸荧光素(FITC-NCS,28 mg,0.072 mmol)的1 mL DMF溶液中,在室温下避光搅拌反应。高效液相色谱(HPLC)跟踪到反应结束,脱掉溶剂浓缩后,粗样品再用柱层析分离纯化,最后得到叠氮异硫氰酸荧光素(FITC-N3,黄色粉末)。
在抗坏血酸钠(4.8 mg,0.024 mmol)和无水硫酸铜(CuSO4,1.92 mg,0.012 mmol)催化作用下,使KCPLGVR(21.8 mg,0.024 mmol)和FITC-N3(14.6 mg,0.030 mmol)发生“点击”反应,产物经HPLC纯化得到KCPLGVR-FITC,最后通过质谱确证结构(淡黄色固体)。MALDI-TOF-MS,C64H89N18O14S2[M+H]+,实验值(计算值)m/z:1397.366(1397.625)。
1.2 Fe3O4纳米颗粒的合成与表征
Fe3O4纳米颗粒按照文献方法制备[14]。在氮气保护下,分别将FeCl3(3.88 g,0.0239 mol)及FeSO4·7H2O(3.34 g,0.012 mol)固体加到280 mL超纯水中,使用搅拌器机械搅拌约1h,待固体充分溶解后,再往上述溶液中滴加68 mLNaOH水溶液(1.59 mol/L),直到溶液pH ≈ 9为止,随着反应进行会有大量黑色沉淀出现,继续搅拌3h使沉淀更加完全。用磁铁分离,依次用超纯水、无水乙醇洗涤,直至沉淀呈中性,最后放入真空干燥箱,在70℃条件下真空干燥,得到Fe3O4颗粒,标定好浓度备用。
图1 KCPLGVR-FITC的合成路线
1.3 Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC的制备
Fe3O4纳米颗粒(160 μg·mL-1,1.0 mL)溶液中加入dp-PEG-Mal(MW = 2K,5 mg,0.5 mL),超声15min后,室温下避光搅拌8h。反应结束后,15000转/分钟离心15min两次洗涤纯化,记为Fe3O4-PEG-Mal。往上述Fe3O4-PEG-Mal(160μg·mL-1,1.0 mL)的TBS(pH = 7.2)溶液中加入溶有KCPLGVR-FITC(50 mg·mL-1,0.02 mL)的二甲亚砜溶液。在室温避光搅拌反应1h后,将溶液离心15min(15000转/分钟),然后用超纯水洗涤3次,洗完后还要用超纯水再分散,标好浓度备用。通过检测水合粒径、Zeta电位、紫外吸收光谱和透射电镜(TEM)对反应前后Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC性质和形貌进行表征。
1.4 探针对MMP-2灵敏度和特异性的体外测试
探针Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC(100 μg·mL-1)在37℃与不同浓度的MMP-2(0,10,20,40,80,160,320,640 ng·mL-1)TBS溶液(pH = 7.2)孵育2h后,利用荧光光谱仪检测不同溶液中荧光信号的变化。在有无MMP-2抑制剂GM6001(0.1 mg·mL-1)存在的条件下,Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC(100 μg·mL-1)和MMP-2(320 ng·mL-1)在37℃时分别孵育2h,然后用荧光光谱仪测定对应溶液的荧光强度。
1.5 细胞荧光成像
小鼠成纤维细胞3T3和人乳腺癌细胞MCF-7分别与50 μg·mL-1探针于5% CO2,37℃下孵育8h。同时在孵育后的人乳腺癌细胞MCF-7中提前加入0.1 mg·mL-1MMP-2抑制剂GM6001开展竞争实验研究,最后通过激光共聚焦显微镜观察细胞荧光成像情况。
图2 (a)KCPLGVR-FITC的HPLC图谱;
(b)KCPLGVR-FITC,Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-
PEG-KCPLGVR-FITC的紫外吸收图谱;
(c) Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-PEG-KCPLGVR-
FITC的TEM照片
2.1 探针的设计、合成与表征
首先,根据合成路线制得FITC-N3,由核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱确认结构(见附图1、2、3)。然后再与KCPLGVR多肽底物中的末端炔通过发生“点击”反应得到KCPLGVR-FITC,产物的结构由HPLC图谱和质谱确证(如图2a和附图4)。然后将dp-PEG-Mal(MW = 2K)修饰于Fe3O4纳米颗粒表面,相应的溶液Zeta电位变为7.9 ± 0.8 mV。最后,KCPLGVR-FITC末端的巯基与纳米颗粒表面的马来酰亚胺发生反应,Zeta电位升至15.8 ± 0.2 mV,表明KCPLGVR-FITC被成功地连接到Fe3O4纳米颗粒表面。如图2b紫外可见吸收光谱显示,修饰了PEG后的Fe3O4纳米颗粒在490 nm处没有明显的紫外吸收。但是连接了KCPLGVR-FITC之后的探针Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC在490 nm处表现出一定的紫外吸收。
表1和图3数据显示,PEG修饰的Fe3O4纳米颗粒以及探针Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC的水合粒径差别不大,都约为45 nm,且TEM结果显示(如图2c),纳米颗粒大小均一,分散性较好,尺寸大小变化较小。
表1 Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC的水合粒径和Zeta电位
图3 Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-PEG-KCPLGVR-
FITC的水合粒径(a)和Zeta电位(b)
2.2 体外实验研究探针对MMP-2的灵敏度和特异性
通过图4a发现,相同浓度的Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC(100 μg·mL-1)荧光强度会随着MMP-2用量的增加而增强,当MMP-2用量达到一定浓度(320 ng·mL-1)后,荧光强度就不再有明显增强,表明此时探针已大部分和MMP-2反应,对MMP-2具有较强的检测灵敏度。如图4b所示,探针与MMP-2反应后的溶液在518 nm处的荧光强度比探针自身背景增强了21倍,而提前加了抑制剂的另一份溶液反应后的荧光强度仅增加5倍,说明该探针对MMP-2具有一定的特异性。
2.3 细胞荧光成像
小鼠成纤维细胞3T3和人乳腺癌细胞MCF-7分别与探针孵育8h后,通过激光共聚焦显微镜对细胞进行成像。通过图5发现,探针与MCF-7细胞孵育后,检测到细胞内有较强的绿色荧光信号;加了抑制剂后再孵育,细胞内的荧光信号被明显抑制;而探针与3T3细胞孵育后仅表现出微弱的荧光信号,以上结果说明探针可以用于MMP-2过表达的肿瘤细胞荧光成像。
图4 (a)相同探针与不同浓度MMP-2反应后的荧光光谱;
(b)探针、探针+ MMP-2以及探针+MMP-2
+抑制剂反应后的荧光光谱。
[探针] = 100 μg·mL-1,
[MMP-2] = 320 ng·mL-1,[抑制剂] = 0.1 mg·mL-1
图5 细胞成像研究:3T3+探针;MCF-7+探针;
MCF-7+抑制剂+探针。[探针] = 50 μg·mL-1,
[抑制剂] = 0.1 mg·mL-1,比例尺 = 60 μm
将表面修饰PEG的Fe3O4纳米颗粒与连接荧光染料FITC的多肽底物KCPLGVR反应,设计合成出一种MMP-2特异响应型荧光纳米探针Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC。体外实验表明,该探针对MMP-2呈现出较高的灵敏度和特异性,并且可用于MMP-2过表达的肿瘤细胞荧光成像,为MMP-2过表达肿瘤的早期诊断、治疗及预后判断提供了重要的依据。
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