崔露莹 陈明丽 余文 李志远 巫升鑫 李东徽 盖梦琦 解敏敏 龚达平 程崖芝
摘 要：为验证NtHDZIV8在腺毛发育过程中的功能，在红花大金元中克隆了NtHDZIV8基因并进行生物信息学分析，通过荧光定量PCR（qRT-PCR）探究了NtHDZIV8的表达模式，进一步利用亚细胞定位与病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术初步验证了NtHDZIV8基因对烟草腺毛发育的调控作用。结果表明，NtHDZIV8进化高度保守，具有典型的HD-LZ、START和SAD结构域，属于HDZIP IV家族。表达模式分析表明，NtHDZIV8在腺毛中高表达，并受植物激素NAA、GA3和MeJA的诱导。亚细胞定位结果显示NtHDZIV8定位于细胞核。病毒诱导本氏烟中NbHDZIV8基因沉默导致长柄腺毛的柄细胞基部膨大，而不影响短柄腺毛形态和腺毛密度。该研究表明NbHDZIV8对烟草腺毛形态具有调控作用，为解析烟草腺毛发生发育调控机制奠定了理论基础。
关键词：烟草；
HDZIV8；
腺毛；
基因沉默
中图分类号：S572.03 文献标识码：A 文章编号：1007-5119（2023）02-0007-08
Abstract：
To verify the function of NtHDZIV8 in the development of glandular trichomes， the coding sequence （CDS） of NtHDZIV8 was cloned from Honghuadajinyuan and further used in bioinformatics analysis. The expression pattern of NtHDZIV8 was analyzed by qRT-PCR， and the role of NtHDZIV8 in development of glandular trichomes was verified using subcellular localization and virus-induced gene silencing （VIGS）. The results showed that NtHDZIV8 was highly conserved and contained typical HD-LZ， START and SAD domains， belonging to the HD-ZIP IV family. The expression pattern analysis showed that NtHDZIV8 was highly expressed in glandular trichomes， and was induced by plant hormones GA3， NAA and MeJA. Subcellular localization results showed that NtHDZIV8 was located in the nucleus. The results of VIGS analysis showed that NbHDZIV8 gene regulated basal expansion of stalk cells in long glandular trichomes， but did not affect the morphology and density of short glandular trichomes in N.benthamiana. The results in this study demonstrate that NtHDZIV8 regulates the development of long glandular trichomes in tobacco， which provides a theoretical basis for the analysis of the regulatory mechanism of tobacco trichome development.
Keywords：
tobacco; HDZIV8; trichomes; virus induced gene silencing （VIGS）
植物毛狀体是植物表皮细胞的特化结构，具有多种重要的功能，包括减少蒸腾作用、调节叶片温度、阻碍昆虫和病原体的攻击[1-2]。普通烟草毛状体通常分为3种类型，即长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和保护毛[3]。本氏烟中有2种类型的腺毛：短柄腺毛与长柄腺毛，没有保护毛[4]。腺毛通常是多细胞的，由3部分组成：基部、柄与腺体。烟草腺毛是大量代谢物生物合成和储存的场所，如二萜化合物、糖脂和抗性蛋白，它们可以影响香气品质，提高烟草的抗蚜虫能力[5-6]，减少叶片真菌感染[7]。已有研究表明HD-ZIP IV亚家族的成员在植物毛状体发生和发育过程中发挥着重要作用[8-9]。HD-ZIP家族成员按照结构特征、保守结构域和生理功能可分为HD-ZIP I、HD-ZIP II、HD-ZIP III和HD-ZIP IV 4个亚家族。其中，HD-ZIP IV亚家族包含了HD、LZ、START与SAD 4种结构域[10]。目前，HD-ZIP IV亚家族成员参与腺毛发育的相关研究主要集中在拟南芥、番茄和青蒿中[11-13]。在青蒿中2个HD-ZIP IV转录因子即AaHD1和AaHD8正向调控腺毛的形成[14]。在番茄中，AaHD8的同源基因SICD2的功能缺失突变体叶片表面VI型腺毛密度降低[15]。Wo也是HDZIP IV家族成员，番茄的Wo等位突变体wolly腺毛数量显著增加[16]。当在烟草中异位表达SIWo时，烟草植株毛状体密度增加[9]。HDZIP IV家族另一成员SIHDZIV8基因沉默后的植株表皮毛显著减少，I型腺毛柄细胞基部膨大[17]。
研究表明番茄SIHDZIV8基因能够影响腺毛密度与形态发育[17]，但在烟草中的同源基因尚未开展研究。因此，本研究通过对普通烟草NtHDZIV8基因进行克隆和生物信息学分析，并在本氏烟中诱导NbHDZIV8基因沉默来研究NtHDZIV8基因在烟草腺毛发育中的功能，为阐明烟草腺毛发生的分子机制奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本試验的植物材料包括普通烟草红花大金元和本氏烟。在25 ℃，光周期16 h/d条件下种植，在普通烟草红花大金元现蕾期，收集腺毛、根、茎、腋芽、幼叶和成熟叶片等组织，液氮速冻后于–80 ℃保存；
本氏烟生长至4叶期时进行农杆菌侵染。
1.2 试验方法
1.2.1 NtHDZIV8基因克隆 以番茄SIHDZIV8 （Solyc03g098200）蛋白序列作为query序列，通过BLAST比对，获得烟草候选基因NtHDZIV8（Ntab0234150），设计特异性扩增引物，上游引物为5"-ATGGAGTACGGCAGCGGA-3"，下游引物为5"-TCAAGAAGTGGAGCAATTCAAGG-3"。以普通烟草红花大金元cDNA为模板进行PCR扩增，获得完整CDS序列。
1.2.2 NtHDZIV8的生物信息学分析 利用ProtParam程序（https：//web.expasy.org/protparam/）预测NtHDZIV8基因编码蛋白质序列的分子量、亲水值和理论等电点；
在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）与茄科数据库（http：//solgenomics. net/）中下载番茄、辣椒、马铃薯、拟南芥、葡萄、水稻、玉米和大豆的蛋白质序列，使用DNAMAN进行多序列比对。使用MGEA X构建进化树（Neighbor-Joining，NJ tree）；
采用GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）分析基因外显子-内含子结构。利用MEME（http：//meme-suite.org/）对保守基序（motif）进行分析。利用在线软件Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测启动子顺式作用元件，并将结果用TBtools可视化[18]。
1.2.3 NtHDZIV8的亚细胞定位 根据NtHDZIV8基因去掉终止密码子的CDS序列，设计特异性扩增引物。上游引物为5"-GACTCTAGAGGATCCATG GAGTACGGCAGCGGA-3"，下游引物为5"-GCTCA CCATGGATCCAGAAGTGGAGCAATTCAAGGC-3"，以红花大金元cDNA为模板扩增目的片段，目的片段回收后连接pCAMBIA1300-GFP载体。在本氏烟中进行瞬时表达，黑暗处理24 h，处理3 d后观察荧光信号[19]。
1.2.4 NtHDZIV8表达模式分析 通过qRT-PCR检测不同组织NtHDZIV8基因的表达量。根据NtHDZIV8 CDS序列，设计特异性扩增qRT-PCR引物，上游引物为：5"-GCAATTGATGTATGAAG AATTGCA-3"，下游引物为5"-CTTGCAAGAAGTG TTAGAATACAGA-3"。以烟草26S rRNA基因作为内参，最后依据2-ΔΔCt算法进行基因表达差异分析[20]。
1.2.5 NtHDZIV8基因沉默 从候选基因NbHDZIV8（Niben101Scf02108g00002.1）选取300 bp片段，使用本氏烟cDNA为模板，用特异性引物（上游引物5"-TAAGGTTACCGAATTCTCAGGGGCT CTAGTAGTGTA-3"，下游引物为5"-AGACGCG TGAGCTCGGTACCAACAGTGCTGCCTATAAGGT-3"）扩增目的片段。通过同源重组将PCR纯化产物与线性化pTRV2载体连接，将重组载体转化到DH5α感受态细胞中并通过测序验证，摇菌提取质粒。将pTRV2：NbHDZIV8、pTRV2和pTRV1载体通过热激法转化农杆菌菌株GV3101。
按照于静[21]的方法，分别挑取pTRV2：
NbHDZIV8、pTRV2和pTRV1单菌落接种于YEB液体培养基中，摇菌至对数生长期，离心收集菌体，用重悬液重悬菌体。28 ℃避光静置2～3 h后，将pTRV1与pTRV2、pTRV2：PDS、pTRV2：NbHDZIV8等体积混合，注射本氏烟叶片。待本氏烟生长20 d左右进行基因表达量检测及腺毛表型观察。
1.2.6 植物激素处理 普通烟草品种红花大金元种子经消毒处理播种在装有灭菌土壤的花盆中，在幼苗长至四叶期时，进行激素处理：分别喷施100 μmol/L的赤霉素（GA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、萘乙酸（NAA）、脱落酸（ABA）和乙烯利（ETH），用蒸馏水喷洒对照幼苗。在处理前和处理后1、3、6、12、24、48和72 h收集叶片放入液氮速冻，–80 ℃保存。通过qRT-PCR鉴定NtHDZIV8基因在不同激素处理下的表达量。
2 结 果
2.1 HDZIV8基因的序列比对及进化分析
对烟草NtHDZIV8蛋白序列与番茄、拟南芥、马铃薯等物种中相似基因进行多重序列比对（图1），结果显示不同物种中HDZIV8蛋白质序列高度保守，属于HDZIP IV亚家族，具有典型的HD-LZ、START和SAD结构域，说明HDZIV8在不同物种中进化保守，可能具有功能上的相似性。为了揭示不同物种中HDZIV8的进化关系，使用MEGA X构建进化树用于系统发育分析，结果表明（图2），烟草NtHDZIV8与番茄SlHDZIV8、辣椒CaHDG11亲缘关系最近。使用GSDS在线程序对不同物种中的HDZIV8基因结构进行分析，发现其外显子与内含子数目均相同。利用MEME软件分析，发现不同物种中HDZIV8保守基序的种类与组织形式一致，暗示了HDZIV8转录因子同源基因间进化保守性和功能相似性。
2.3 NtHDZIV8基因全长CDS序列克隆及序列分析
基于以上生物信息学分析，设计特异性扩增引物，以红花大金元的总cDNA为模板扩增NtHDZIV8基因，目的片段约2100 bp（图3）。将目的片段进行纯化回收并连接TA克隆载体，挑取单克隆测序。结果表明NtHDZIV8基因CDS序列全长2154 bp，编码了717个氨基酸。利用ProtParam分析NtHDZIV8蛋白质的理化性质，该蛋白相对分子量为79.03 kDa，蛋白亲水值为–0.280，理论等电点为6.27。
2.4 NtHDZIV8转录因子亚细胞定位
通过构建35s：：NtHDZIV8：：GFP融合载体，瞬时转化本氏烟叶片，检测NtHDZIV8融合GFP表达蛋白的分布情况（图4）。试验发现，转入35s：：GFP融合载体的对照组中，绿色荧光信号存在于细胞核与细胞膜中；
转入35s：：NtHDZIV8：：GFP融合载体的试验组中，绿色荧光信号只在细胞核中存在，DAPI染色后观察发现细胞核被染成蓝色，表明NtHDZIV8定位在细胞核中。
2.5 NtHDZIV8表达模式分析
为了进一步探究NtHDZIV8的功能，通过qRT-PCR对NtHDZIV8基因在不同组织部位的表达模式进行分析（图5）。结果显示，NtHDZIV8在根（R）中不表达，在幼叶（YL）、花蕾（FB）、腋芽（LB）和腺毛（GL）等部位中均有表达，在腺毛（GL）中表达量最高，说明NtHDZIV8基因可能参与烟草腺毛发育过程。
2.6 NtHDZIV8基因功能鉴定
PDS基因为八氢番茄红素脱氢酶，沉默PDS基因后，植株葉片会出现白化现象。在注射本氏烟20 d时，PDS沉默植株新叶上出现大面积漂白，从对照植株和NbHDZIV8沉默植株上取与白化叶片相同位置的叶片（图6A）进行表达量鉴定（图6B）；
在NbHDZIV8沉默植株中选择表达量降低50%以上单株的进行表型观察。结果发现与对照植株相比，NbHDZIV8沉默植物短柄腺毛形态未发生变化，但是长柄腺毛柄细胞基部膨大（图6C、6D）；
腺毛密度没有明显差异（图6E）。这些结果表明烟草NbHDZIV8参与调节腺毛的形态发育。
2.7 NtHDZIV8基因对不同植物激素的响应
通过qRT-PCR探究植物激素对NtHDZIV8基因的调控作用。结果表明（图7），NtHDZIV8响应多种植物激素，其中对NAA与GA3响应最为明显。在NAA处理条件下，NtHDZIV8在24 h基因表达量是0 h的3倍；
在GA3处理条件下，表达量在24 h上升，48 h表达量降低，72 h表达量达最高，是对照的4倍。此外，ETH处理过程中，该基因24 h基因表达量最高，但不超过0 h两倍。MeJA处理过程中，该基因表达量在24 h之前逐渐降低，而在48 h之后升高。上述结果表明NtHDZIV8受植物激素NAA、GA3和MeJA的诱导。
3 讨 论
HD-ZIP IV基因在进化过程中是保守的，植物特异性HD-ZIP IV参与了表皮细胞的调节，毛状体和气孔的模式化[9， 15]。本试验从普通烟草中克隆获得NtHDZIV8基因，生物信息学分析表明NtHDZIV8具有HD、LZ、START和SAD结构域，蛋白序列高度保守。通过亚细胞定位显示NtHDZIV8蛋白在细胞核中发挥作用，符合转录因子的特性。HD-ZIP IV转录因子已被证明在许多植物的毛状体发育中起关键作用。作为NtHDZIV8同源基因，拟南芥AtHDG11与番茄SIHDZIV8均参与毛状体的发育。AtHDG11突变体中表皮毛分支增多，AtHDG12增强了AtHDG11突变体中毛状体的过度分支形态[22]。番茄中SIHDZIV8 RNAi植株I型腺毛柄细胞基部膨大，I、III和V型毛状体密度显著降低[17]。SIHDZIV8主要在幼叶和毛状体中表达，AtHDG11在幼叶和花蕾中的表达量较高，其根部也有表达[22]。对不同组织部位的NtHDZIV8表达量进行分析，发现其在腺毛、幼叶、花蕾和腋芽中表达较高，而茎与成熟叶片表达较低，在根中不表达；
烟草幼嫩叶片、花蕾和腋芽表面密布腺毛，成熟叶片腺毛密度下降[23]，NtHDZIV8表达模式与烟草腺毛的分布部位结果一致，与SIHDZIV8表达模式相似，与拟南AtHDG11在根部表达量存在差异。NtHDZIV8在烟草根部不表达说明NtHDZIV8可能不参与根毛发育，只与腺毛发育有关，因此推测NtHDZIV8可能与SIHDZIV8功能相似，是一个潜在的腺毛正调控因子。为了探究NtHDZIV8对烟草腺毛的影响，本试验从本氏烟中克隆了NbHDZIV8基因，通过VIGS技术验证NbHDZIV8基因功能，发现NbHDZIV8沉默的本氏烟长柄腺毛柄细胞基部膨大，呈典型的葫芦状，与番茄中发生扭曲的腺毛表型一致；
短柄腺毛形态没有变化。番茄I型腺毛顶端有一个较小的腺体与一个多细胞的颈部，是7种番茄毛状体中最长的[24]；
本氏烟长柄腺毛与番茄I型腺毛形态相似，属于多细胞腺毛，推测NbHDZIV8基因主要影响多细胞腺毛柄细胞中细胞板形成。番茄中SIHDZIV8 RNAi植株腺毛密度降低，但在NbHDZIV8 RNAi植株中没有观察到腺毛密度的显著变化，推测该基因在不同物种中功能存在差异。
植物激素是植物生长发育的关键调节因子，已有研究证明生长素[25]、赤霉素[26]、茉莉酸[14，27]能够参与毛状体发育。研究表明，青蒿中AaHD1转录活性被AaJAZ8抑制[14]；
在番茄中，SIJAZ2过表达降低腺毛密度[27]；
SIARF4抑制SIMYB75表达，增加番茄II、V和VI型毛状体密度[25]。脱落酸响应基因AtSVB、AtSVB2[28]与乙烯受体ETR2[29]是拟南芥毛状体发育的重要调控因子。本研究通过qRT-PCR检测NtHDZIV8在烟草植株受到5种不同激素处理后的表达量，发现植物激素GA3、NAA和MeJA能够影响NtHDZIV8的表达。通过启动子顺式作用元件分析，发现NtHDZIV8具有MYB结合位点与茉莉酸响应元件，推测NtHDZIV8可能通过JA途径调控烟草腺毛形态发育。并且这些激素是植物应对非生物胁迫的关键调节信号，可能通过调控基因表达影响植株发育，NtHDZIV8基因可能是提高作物对非生物胁迫耐受性的良好靶基因。
4 结 论
研究证明，NtHDZIV8在进化过程中高度保守，在细胞核中发挥作用，属于HDZIP IV家族。表达模式分析发现NtHDZIV8在烟草茎、叶、花蕾、腋芽组织中都有表达，在腺毛中表达量高于其他组织，并受到激素GA3和NAA和MeJA诱导。沉默NbHDZIV8使本氏烟中长柄腺毛基部细胞膨大，证实NbHDZIV8能够调控烟草腺毛形态发育。为阐明NtHDZIV8在烟草腺毛发育中功能及分子机制提供了基础。
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